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浅谈临床PCR试剂盒的更新换代

发布时间2019-10-11        浏览次数:93

    自从PCR技术作为临床诊断方法以来,实验室污染一直是影响检测质量的罪魁祸首。虽经多次技术改进和换代,实验室污染就像冬季的雾霾很难彻底去除,特别是“自动化核酸提取仪”在临床应用,如果进行严格的污染监控,几乎所有的核酸提取仪器都会沦陷。这也许是我们无颜去响应欧肝会(HBV DNA<10~15IU/mL)或美肝会HBV DNA<5~10IU/mL)倡导的灵敏性。
    回顾历次PCR技术的更新换代,似乎都遵循了这样一个规律,那就是新一代试剂盒或多或少会解决上一代技术存在的问题,如检测敏感性逐渐得到提升、检测步骤逐渐得到简化、实验室污染逐渐得到控制,现就PCR技术的历次更新换代分析如下。
    di一代试剂盒
    即采用电泳法进行结果鉴定,那时实验室人员对污染还没有清楚的认识,当从“饮水中”也扩增出“结核杆菌”时,才意识到问题的严重性,于是1998年卫生部暂停PCR技术在临床诊断中的应用。人们把污染的元凶归结为“电泳”二字,随后出现了“ELISA-PCR”或杂交梳等核酸检测方法,由于同样是产物开放性鉴定,并没有改变污染成灾的事实,反而使人们对PCR技术能否用于临床诊断产生了质疑!
    第二代试剂盒
    即实时荧光PCR技术的产生,由之前的开放性核酸鉴定方法,变成由荧光染料或Taq MAN探针为信号源的闭管鉴定,避免了扩增产物外泄的实时荧光PCR技术,事实证明实验室污染并没有得到完全控制,于是有些专家把罪魁祸首归结为“煮沸”带来的气溶胶,同时认为“煮沸”得来的核酸干扰物质太多,是影响检测敏感性的主要原因。
    第三代试剂盒
    即“微量核酸释放剂”法,2002年本人根据HBV DNA的高度稳定性和对PCR扩增条件要求不高等特点,研发出无需进行核酸提取或纯化的“一步法”HBV DAN检测技术,由于操作方法简单、快速,很受实验室人员欢迎,在接下来的几年里,陆续有试剂厂家获得注册证书。“一步法”避免了煮沸法导致的气溶胶,也简化了操作步骤,但实验室污染也并未因此得到解决,这也是许多人无法理解的问题!
    第四代试剂盒
    即“磁珠”核酸提取技术,是免疫化学发光自动化技术的应用,促使了核酸自动化的变革,磁珠核酸制备方法实现了仪器批量操作,也就是所谓的自动化。第四代试剂盒与第二代和第三代试剂盒的不同,磁珠法获得的核酸纯度和和得率都较传统方法有大幅度提升,也就出现了“高敏”、“超敏”等名词。其实,磁珠核酸制备方法非但与“柱提法”没有本质区别,反而如果核酸制备过程存在动力混匀、加热、核酸洗脱、移管、磁珠残留等环节,形成污染“PM2.5”的几率远远高于“柱提法“,这也是动态核酸制备无法避免污染的根源所在。罗氏COBAS采用SPU进行核酸制备,在检测量不大的情况下实验室污染并不明显,但其他形式的“全自动或半自动核酸提取仪”,虽然都植入了预防污染的概念,但实践证明,污染均难防难清。
    第五代试剂盒
    即静态核酸制备技术。该技术的发明算是突破传统的“黑科技”,核酸制备过程直接在PCR扩增管中进行;样本直接加到核酸裂解液中无需混匀(静态加样),同时还避免了吹打混匀导致的核酸丢失;核酸漂洗无需混匀磁珠(静态漂洗);废液封闭收集;核酸磁珠参与PCR扩增(无核酸磁珠外露)。这种静态核酸制备技术不但实现了“污染可控”,还大大降低了操作技术门槛、提升了PCR检测的稳定性和重复性。

    第五代试剂盒的出现,解决了上面四代试剂盒存在的诸多缺陷,zui大的收益是“简单快速”、“实验室污染可控”和“结果的高度重复性”,应该说是临床荧光PCR技术的一场革命。






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